依据《中药复方制剂整体质量评价体系的构建及应用》中关于构建中药复方制剂整体质量评价体系的技术路线，按照《达立通颗粒整体质量研究方案》，开展达立通颗粒整体质量评价研究，包括研发立项研究、组方和方解研究、中药材/饮片质量研究、生产过程控制技术研究、作用机制研究、质量标志物和生物标志物研究、循证医学研究、药物经济学研究。根据项目进展情况，我们将陆续报道相关研究成果。

本期介绍2023年度达立通颗粒促进胃肠动力的药效物质基础与主要促胃肠动力药效成分及PK-PD标志物研究成果总结。

摘要

借助HPLC-Q-TOF/MS 高通量测定技术分析达立通颗粒中的小分子成分，鉴定出108个化合物，采用网络药理学方法分析达立通颗粒作用的通路与靶标。以功能性消化不良（FD）胃肠推进率为考察指标和因变量 Y，以不同提取方式下达立通颗粒的提取物小分子化合物及丰度为自变量 X，应用主成分分析（PCA）、灰色关联分析（GRA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）三种分析方法，建立达立通颗粒与FD之间的谱效关联，筛选出达立通颗粒调节胃肠动力的10个主要成分。进一步在斑马鱼蠕动模型中进行研究和验证，发现桔皮素、川陈皮素、橙皮苷等具有显著的促进斑马鱼胃肠道蠕动效果，提示为达立通颗粒药效物质基础和促进胃肠动力主要药效成分及PK-PD标志物。

关键词

达立通颗粒；胃肠动力；斑马鱼模型；桔皮素；川陈皮素；橙皮苷

1、研究目标

研究达立通颗粒中促进胃肠动力的物质成分群与主要药效成分和PK-PD标志物。

2、研究方法

2.1 仪器与试剂

AB Sciex Triple TOFTM 5600质谱仪（美国AB Sciex公司），LC-20A快速液相仪（日本Shimadzu公司），Milli-Q超7纯水机（美国Millipore公司）。

乙腈、甲醇（色谱纯，德国默克公司），甲酸（色谱纯，阿拉丁试剂有限公司），乙醇（分析纯，南京化学试剂股份有限公司），石油醚、乙醚、乙酸乙酯和正丁醇购自国药集团化学试剂有限公司，纯水（实验室自制）。

2.2 网络药理学研究

2.2.1 成分-靶点网络的构建

首先通过PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取60个达立通颗粒给

药后进入胃肠道的成分的SMILE号，录入Swiss Target Prediction数 据 库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）（选择“Homo sapiens”）中导出其预测的各胃肠成分的相关作用靶点，建立“有效成分-靶点”对应网络。随后将该网络导入Cytoscape 3.8.2软件完成达立通颗粒促胃肠动力成分对FD作用的“成分-靶点”网络图的构建。最后，基于各成分的Degree值对达立通颗粒促胃肠动力成分进行排序。

2.2.2 药物、疾病交集靶点获取与匹配

在OMIM（https：//www.omim.org/）、DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）和GeneCards（https：//www.genecards.org/，选择relevance score>2）三个数据库中分别输入“Functional dyspepsia”分别获得与FD相关作用靶点，整合3个数据库信息以及相关文献报道，得到与FD相关的靶点信息。然后通过 Excel对上述成分对应靶点和疾病对应靶点进行Venn （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）分析，得到达立通颗粒作用于FD的靶点。

2.2.3 PPI网络构建及分析

将上述2.1.2项下交集靶点导入String数据库（https：//cn.string-db.org/），剔除孤立靶点（hightest confidence选择0.9000）后导出TSV文件格式的蛋白互作（Protein-Protein Interaction,PPI）信息，导入Cytoscape 3.8.2构建PPI网络图，筛选出与FD相关的前10个的核心靶点。

2.2.4 KEGG富集分析

将交集靶点导入DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/，选择“OFFICIAL-GENE SYMBOL”，输入“homo sapiens”并设置P<0.05）进行京都基因与基因组百科全书 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路分析。根据靶点富集程度排列数据，筛选出最相关的30条通路，并在微生信平台（https：//www.bioinformatics.com.cn/）对其进行可视化。

2.3 样品采集与制备

2.3.1 供试品溶液的制备

称取15份57.5g达立通颗粒（相当于100g生药材），分别用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇和75%乙醇等五种不同溶剂提取（n=3）。3倍体积溶剂提取三次后合并提取液，分别浓缩至100mL（即生药浓度约1g/mL）。各取1mL挥干，加入800µL甲醇并超声振荡30min，12000 rpm 离心10min后，分别收集所有样品的上清液进样。剩余提取物挥干，重新溶解在0.5%CMC-Na 溶液中4℃保存待用。

2.3.2 达立通颗粒药液的配制

达立通颗粒高、中和低剂量组药液的配制：分别称取8.82 g、5g和2.5g达立通颗粒，研磨成粉后加入10.5mL、8.9mL、和9.6mL纯水后超声振荡30min，冷却后置于4℃冰箱保存待用。

2.3.3 对照品溶液的制备

参照前期研究资料配制。

2.3.4 实验饲料的配制

10gCMC-Na充分溶于200 mL热水中制成透明黏稠半固体，依次加入16g脱脂奶粉和8g蔗糖，充分搅拌均匀后，加入4g活性碳，配制成250mL最终比重为1.1g/mL的黑色半固体糊状实验餐。

2.4 动物实验

2.4.1 给药方案

取由上海市计划生育科学研究实验动物经营部（中国上海）提供的24只体重为18g～22g的雄性ICR小鼠（实验动物许可证编号为SYXK（沪）-2018-0002。适应性饲养1周，期间自由饮食饮水，自动开关灯模拟正常昼夜交替。小鼠随机分为4组（n=6），空白组（CON）、达立通颗粒高剂量组（DLT-H：10.5g/kg）、中剂量组（DLT-M：5.2g/kg）和低剂量组（DLT-L：2.6g/kg）。

另取由上海市计划生育科学研究实验动物经营部（中国上海）提供的110只体重为18g～22g的雄性ICR小鼠（实验动物许可证编号为SYXK（沪）-2018-0006）。所有动物饲养均参照上述方法。随后将小鼠随机分为11组（n=10），空白组、达立通颗粒不同溶剂提取液组（石油醚组-PE、乙醚组-EE、乙酸乙酯组-EA、正丁醇组-NB、水提醇沉组-WEAP，各组分别n=2），按达立通颗粒高剂量（10.5g/kg）给药，每天1次，连续7天。

2.4.2 胃肠推进考察

按动物实验流程图进行实验，在最后一次给药前18h禁食不禁水，给药后45min各组动物均给予0.4mL实验餐，20min后脱颈处死动物，解剖后迅速打开小鼠腹腔，按肠推进考察方法进行实验，记录为L小前和L小总并代入公式。

小肠推进率=L小前/L 小总×100 %。

2.5 色谱条件与质谱条件

色谱柱：Hypersil GOLDTM 色谱柱（100mm×2.1mm, 3m），柱温：40℃，流动相A为0.1%甲酸水（v/v），流动相B为乙腈。流速为0.4 mL/min ，进样量为3 μL。梯度洗脱程序：0～5 min，10% B；5～44 min，90% B；44～46 min，90% B；46～47 min，90-10% B；47～50.1 min，10% B。

电喷雾离子源（ESI），离子源温度（TEM）550℃，气帘气（CUR）40psi，雾化气（GS1）55psi，辅助加热气（GS2）55 psi，离子源喷雾电压（IS）5500V/-5500V，碰撞电压（CE）10V/-10V，去簇电压（DP）100V/-100V，扫描范围为m/z50～1500。

2.6 数据处理

以前期所鉴定的达立通颗粒中的108个化学成分为基础，确定各不同提取溶剂提取的化学成分并进行编号。随后，采用多种化学计量学方法建立上述质谱数据和胃肠推进指标的联系以筛选达立 通颗粒的潜在促胃肠动力成分。采用MetaboAnalyst 5.0 （https：//www.metaboanalyst.ca/faces/home.xhtml）进行主成分分析（Principal Component Analysis, PCA），采用Excel进行灰色关联分析（GreyRelational Analysis,GRA）和SIMCA14软件进行正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA）。

2.7 达立通颗粒中潜在促胃肠动力成分对斑马鱼肠道蠕动的影响

斑马鱼消化道的解剖结构和细胞结构与人类消化道相似，具有同心圆层的内上皮、结缔组织、环状肌肉和外纵肌层。因此，可利用斑马鱼模型评价调节胃肠功效。

2.7.1 最大耐受浓度测定

随机选取受精后6d的斑马鱼胚胎于24孔板中，每孔10尾，分别加入1mL的药物（桔皮素、延胡索乙素、去甲基川陈皮素、川陈皮素、延胡索碱、橙皮苷、金丝桃苷、柠檬苦素、四氢小檗碱），同时设置对照组（不含药物）。处理24h后，观察并记录斑马鱼的死亡情况，确定各药物对斑马鱼的最大耐受浓度。

2.7.2 斑马鱼肠道蠕动模型的建立及给药

将5d龄的野生型AB斑马鱼置于24孔板中，每孔15尾，设置对照组、模型组、多潘立酮（30μg/mL）组、桔皮素（20μM/mL）组、延胡索乙素（37.5μM/mL）组、去甲基川陈皮素（10μM/mL）组、川陈皮素（12.5μM/mL）组、延胡索碱（37.5μM/mL）组、橙皮苷（200μM/mL）组、金丝桃苷（300μM/mL）组、柠檬苦素（200μM/mL）组、四氢小檗碱（75μM/mL）组。各组加入1mL 尼罗红（10μg/mL），作用16h后清洗3遍。除对照组外，其余各组给予1mL盐酸洛哌丁胺（20μg/mL）造模，对照组用胚胎培养水正常培养。造模同时，各给药组给予1mL相应浓度的药物，对照组和模型组给予等体积胚胎培养水，于28℃恒温水浴避光培养24h。

2.7.3 斑马鱼的肠蠕动促进率测定

给药24h后，用 0.02%三卡因进行麻醉。各组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下对胃肠部进行拍照，计算斑马鱼肠道内容物（尼罗红）平均荧光强度（Mean），用Image J图像处理软件进行统计，计算肠蠕动促进率。

肠蠕动促进率＝1－（Mean给药－Mean对照）/（Mean模型－Mean对照）

3、结果

3.1 达立通颗粒治疗FD的作用靶点及关键成分

3.1.1 成分-靶点的网络构建及分析

通过Swiss Target Prediction数据库检索并去重后，成功找到药物靶标688个的“有效成分-靶点”网络图。该图共有60个达立通颗粒入胃肠道的活性成分，包含750个节点和4165 条边，连线表明达立通颗粒促胃肠动力有效成分与靶点之间的靶向关系。

3.1.2 达立通颗粒作用于 FD 的靶点

三个数据库和文献搜索、筛选以及合并去重后得到达立通颗粒与FD密切相关的靶标共1964 个。与成分对应靶点进行Venn 分析并导出获得的308个共同靶点，该靶点即是达立通颗粒对FD起治疗作用密切相关的靶点。

3.1.3 PPI网络的构建及核心靶点、关键成分的挖掘

PPI网络图以达立通颗粒有效成分治疗FD的266个靶点为节点，以1556条靶点间的相互作用为边。其粗细与相互作用的强弱成正比，大小与该靶点的Degree值成正比，边代表以度值、介数和接近中心性3个参数为基础，选取中值以上的靶点作为潜在靶点，排在前10位的靶点有SRC、TP53、HSP90AA1、PIK3R1、STAT3、PIK3CA、MAPK3、MAPK1、HRAS和AKT1。

按达立通颗粒有效成分的 Degree值排序。以达立通颗粒治疗FD的前10位核心靶点为基础，根据度值大小，将核心靶点对应的达立通颗粒胃肠有效成分进行排序。

结果表明，包括：川陈皮素、甜橙黄酮、金丝桃苷、桔皮素、柠檬苦素、橙皮苷、紫堇鳞茎碱、延胡索乙素、去甲基川陈皮素、四氢小檗碱、药根碱、小檗碱、芹菜素和环氧橙皮油内酯等成分排名靠前，为达立通颗粒治疗FD的关键成分。

3.1.4 KEGG富集分析

KEGG通路富集图分析结果表明，与FD密切相关的富集信号通路主要包括图中所示的前三十条。如PI3K-Akt信号通路、脂质与动脉粥样硬化、MAPK信号通路、局灶性粘连、Ras信号通路、AGE-RAGE信号通路、Rap1信号通路、5-HT相关神经突触、化学致癌作用-受体激活、化学致癌作用-活性氧、FoxO信号通路、趋化因子信号通路、cAMP-钙信号通路。其中值得关注的是血清素能突触、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路和钙信号通路等，近几年逐渐被学者考虑用于FD的机制研究。

3.2 不同溶剂提取达立通颗粒的图谱生成

基于前期工作，本研究鉴定出的108个常见峰的成分，建立了5个不同组分提取达立通颗粒的HPLC-Q-TOF/MS的指纹图谱。首先，通过参考文献和 TCMSP数据库建立了达立通颗粒标准物质库。其次，利用 HPLC-Q-TOF-MS/MS对各达立通颗粒提取液内的化学成分进行收集，利用PeakView中的XIC对各达立通颗粒提取物的指纹图谱进行分析。可以看出，达立通颗粒中108个化合物在不同组分中的数量分布差别较大，且不同组分之间的丰度（即含量）也存在差异。

3.2 达立通颗粒对正常小鼠肠道推进率的影响

3.2.1.达立通颗粒对正常小鼠小肠推进率的影响

达立通颗粒对正常小鼠小肠推进率的影响研究结果表明，与空白组相比，达立通颗粒给药组小鼠小肠推进率增加，中剂量和高剂量给药达立通组具有显著性差异，特别是高剂量（10.5g/kg）给药促胃肠动力效果最好（****P<0.0001）。故后续实验选择10.5g/kg（以生药量计）给药。

3.2.2 不同溶剂提取达立通颗粒对正常小鼠小肠推进率的影响

对达立通颗粒用不同溶剂提取后的组分进行试验，考察对正常小鼠小肠推进率。结果表明，各组较空白组胃肠推进均有提高，其中石油醚组、乙醚组和乙酸乙酯组给药后小鼠促胃肠动力有不同程度的提升，但不具有显著性差异；正丁醇组给药小鼠促胃肠动力与空白组相比具有差异（*P <0.05），水提醇沉组小肠推进率也显著升高**P＜0.01），表明水提醇沉处理方式促胃肠动力效果最接近与达立通颗粒给药。

3.3 化学计量学分析

3.3.1 PCA分析

PCA是在无监督模式下进行的多元统计分析，其贡献率是指主成分的方差在被研究的变量总方差中所占的比例。故主成分的贡献率越高，其所包含样本的代表性就越高。本研究利用MetaboAnalyst 5.0网站（https：//www.metaboanalyst.ca/faces/home.xhtml）分析达立通颗粒不同溶剂提取部位的原型成分差异。结果表明，前三个主成分的累积贡献率高达80%（PC1+PC2+PC3=81.70 %），因此这三个主成分可代替 5 个不同溶剂提取达立通颗粒的大部分信息，可以解释108个峰的统计学意义。

按照各成分响应强度柱状堆叠图，结合各成分的PCA载荷量筛选对达立通颗粒的质量影响较大的成分。结果表明，达立通颗粒中黄酮类成分和生物碱类成分含量较高且载荷量较大，可作为达立通颗粒的主要成分。包括：桔皮素、川陈皮素、5-羟基-3,6,7-8,3'-4'-六甲氧基黄酮、甜橙黄酮、别隐品碱、延胡索碱、巴马汀、延胡索乙素、原阿片碱、元胡宁、去甲基川陈皮素、去氢海罂粟碱、柠檬苦素、香叶木苷、四氢非洲防己碱、橙皮苷、野漆树苷、药根碱、芸香柚皮苷、鸡矢藤苷酸、高圣草素、金丝桃苷、紫堇鳞茎碱、环氧香柠檬素、车叶草苷酸、橙皮素、去氢木香内酯、香风草苷、5-羟基-3-7-8-3'-4'-五甲氧基黄酮、黄连碱、新圣草苷、柚皮苷、香叶木素-7-O-葡萄糖苷、木香烃内酯、芦丁、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、圣草次苷、槟榔碱和四氢小檗碱共计39个成分。

3.3.2 GRA分析

GRA也属于一种基于原始数据采用均值变化法进行无量纲处理的多因素统计分析方法。本研究将小鼠药效指标小肠推进率作为母序列，5 个不同溶剂提取达立通颗粒的108个化合物的峰面积作为子序列，计算关联度（r）。r 越大，表明该成分与胃肠推进的关联越大。本研究根据r≥0.75进行筛选，共筛选出43个与胃肠推进相关性较大的化合物，包括：川陈皮素、柚皮素、橙皮素、槲皮素、木香烃内酯、延胡索碱、桔皮素、延胡索乙素、柠檬苦素、去甲基川陈皮素、紫堇鳞茎碱和橙皮苷等黄酮和生物碱类化合物。虽然GRA可以非常快速的筛选出跟目标药效相关的有效成分。但是也存在一些缺点，计算出的r均为正数，其数值的大小只能反映化合物与药效相关性大小，并不能反映呈负相关的那部分化学物，所以并不能单纯的使用GRA一种方法来评价单味药或复方中全部化合物对药效指标的综合贡献。

3.3.3 OPLS-DA分析

OPLS-DA是基于PLS，把连续的变量正交（orthogonal）投射到latent structure，从而把变量分成了可以预测的和无关的两种，也属于多因素统计分析方法之一。不同溶剂提取达立通颗粒 OPLS-DA、VIP值排序图、载荷散点图和置换检验拼合图。由此可知OPLS-DA模型将不同溶剂提取的样本区分开来，且拟合模型预测成分的累计统计量R²X=0.921、模型解释率参数R²Y=0.998、预测能力参数Q²=0.980，均高于0.5，表示 OPLS-DA模型对达立通颗粒药效物质的分析预测能力较好。此外本研究还进行OPLS-DA模型验证（置换检验n=200），发现 R²=0.806、Q²=-1.16，右侧的R²和Q²均高于左侧，且Q²与Y轴交于负半轴，说明该模型可靠，不存在过拟合现象。

计算化学成分与药效指标的VIP值，根据VIP值＞1 进行筛选，共筛选出25个与药效指标小肠推进率相关性较强的成分，包括：桔皮素、5-羟基-3,6,7-8,3'-4'-六甲氧基黄酮、延胡索乙素、别隐品碱、巴马汀、去甲基川陈皮素、川陈皮素、橙皮苷、木香烃内酯、延胡索碱、柠檬苦素和紫堇鳞茎碱等，主要为黄酮和生物碱类的化合物。

3.3.4 统计分析总结

根据PCA、GRA 和 OPLS-DA 统计分析结果，筛选出10个化合物可能是达立通颗粒调节胃肠动力的主要活性成分，包括：桔皮素、延胡索乙素、去甲基川陈皮素、川陈皮素、延胡索碱、橙皮苷、金丝桃苷、紫堇鳞茎碱、柠檬苦素和四氢小檗碱。

3.4 基于斑马鱼蠕动模型的达立通颗粒中潜在促胃肠动力成分的效应验证

在前期筛选出的10种化学成分中，紫堇鳞茎碱无法购买到相应的对照品，我们仅仅测试了其余9种成分对斑马鱼肠蠕动的影响。

我们首先测试了不同浓度的上述成分对斑马鱼死亡率的影响。结果表明，桔皮素、延胡索乙素、去甲基川陈皮素、川陈皮素、延胡索碱、橙皮苷、金丝桃苷、柠檬苦素和四氢小檗碱的最大耐受剂量分别为20μg/mL、37.5μg/mL、10μg/mL、12.5μg/mL、37.5μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、200μg/m、75μg/mL。

达立通颗粒中潜在促胃肠动力成分的效应验证结果表明，与对照组比较，模型组斑马鱼肠道内容物荧光强度明显增强；除延胡索乙素外，其余达立通颗粒各给药组斑马鱼肠道内容物荧光强度与模型组比较明显降低。经计算各组斑马鱼的胃肠道蠕动促进率，发现桔皮素、延胡索乙素、去甲基川陈皮素、川陈皮素、延胡索碱、橙皮苷、金丝桃苷、柠檬苦素和四氢小檗碱的胃肠蠕动促进率分别为90.90%（p< 0.01）、6.48%（p＞0.05）、54.55%（p< 0.01）、88.55%（p< 0.01）、45.92%（p<0.05）、65.07%（p<0.01）、50.65%（p< 0.01）、36.17%（p<0.05）和 51.86%（p<0.01）。其中延胡索乙素未见明显的促胃肠道蠕动能力，其余各成分的促胃肠道蠕动能力依次为桔皮素>川陈皮素>橙皮苷>去甲基川陈皮素≈四氢小檗碱≈金丝桃苷>延胡索碱>四氢小檗碱。

4、结论与讨论

采用高通量测定技术分析和鉴定达立通颗粒中108个小分子化合物，采用多模式谱效关联分析筛选出达立通颗粒调节胃肠动力的10个主要成分：桔皮素、延胡索乙素、去甲基川陈皮素、川陈皮素、延胡索碱、橙皮苷、紫堇鳞茎碱、金丝桃苷、柠檬苦素和四氢小檗碱。斑马鱼模型研究发现桔皮素、川陈皮素、橙皮苷等具有显著的促进斑马鱼胃肠道蠕动效果，提示为达立通颗粒主要药效成分。

考虑到中药复方多成分、多靶点的特点，采用网络药理学对达立通颗粒中的潜在活性成分进行了研究。PPI网络、KEGG通路富集结果为其后续药理机制研究提供了新的思路。另外，筛选出包括川陈皮素、甜橙黄酮、金丝桃苷、桔皮素、柠檬苦素、橙皮苷、紫堇鳞茎碱、延胡索乙素、去甲基川陈皮素、四氢小檗碱、药根碱、小檗碱、芹菜素和环氧橙皮油内酯等化合物作为达立通颗粒治疗FD的关键成分。值得注意的是，针对目前文献中鲜有报道达立通颗粒的药效物质基础及潜在促胃肠动力成分，还需要相关药理实验结果进一步验证。

“谱-效”关联分析可快速发现中药药效学物质基础。多种化学计量学方法联用在利用谱效关系筛选中药有效活性成分方面起到了至关重要的作用。本研究通过三种统计分析方法联用，以FD经典临床症状胃肠推进障碍为药效指标，建立达立通颗粒与FD之间的谱效关联，筛选了不同溶剂提取的达立通颗粒治疗FD促进胃肠运动的关键活性成分。根据各成分的载荷量、关联度和VIP值，筛选出以下10个成分，包括：桔皮素、延胡索乙素、去甲基川陈皮素、川陈皮素、延胡索碱、橙皮苷、金丝桃苷、紫堇鳞茎碱、柠檬苦素和四氢小檗碱，作为达立通颗粒治疗FD的潜在促胃肠动力成分。进一步在斑马鱼肠蠕动模型中确证了其中8种成分具有较好的促胃肠道蠕动能力。

 

本文仅供专业人士参考。

 

本文综合整理自南昌弘益药物研发团队，欢迎转发，禁止转载，转载授权请联系0791-88161315。